1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35
1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36
1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39
1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39
1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39
1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA – DNA ……………………………………………………………………………39
1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40
1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40
1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42
1 _16_1_تکنیک‌های ژنومی که اساس آنها PCR نمی‌باشد …………………………………………………………………..42
1_16_1_2_انگشت‌نگاری DNA به روش RFLP …………………………………………………………………………….43
1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50
1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب‌ها در RFLP……………………………………………………………………….. 50
1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51
فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) …………………………………………………………………………………………55
2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56
2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58
2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65
فصل سوم (مراحل روش تحقیق) ………………………………………………………………………………………………………70
3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71
3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71
3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71
3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73
3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73
3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73
3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74
3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74
3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74
موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74
3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74
3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76
3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76
3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76
3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76
3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78
3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79
3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون ………………………………………………………………………80
3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80
3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81
3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82
3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82
3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82
3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83
3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83
3_4_7_2_ کنترل و جمع آوری سلولهای باکتری رشد یافته ……………………………………………………………..83
3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84
3_4_8_ارزیابی کیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86
3_4_8_1_ارزیابی کفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86
3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86
بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86
ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86
3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88
3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90
3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91
3-4-9- الکتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92
RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92
3_4_10_هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93
3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94
3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94
3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94
3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96
3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96
3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97
3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98
3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98
3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99
3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون………………………..99
3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100
3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101
3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102
3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102
3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102
فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104
نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105
4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105
4-2- بررسی کشت لوله های لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………………………..105
4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106
4-3-1- نتایج واکنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106
4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107
4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108
4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109
4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110
فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114
پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126
منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127
فهرست جدول ها
عنوان جدول صفحهجدول1-1نامگذاری مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………………………. 8جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف کندرشد مایکوباکتریای ……………. 33جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونههای مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی ……………….. 35جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقدههای لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ……………………………….. 71جدول 3-2: لیست مواد مصرفی …………………………………………………………………………………………………………… 72جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون ………………………………………………………………… 79جدول 3-4: تستهای تعیین هویت مایکوباکتریومها ………………………………………………………………………………. 81جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر ………………………………………………………………………………….. 91جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها ………………………….. 113
فهرست شکل ها
عنوان شکل صفحهتصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010……………………………………………………………………………………….. 6تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها ……………………………………………………………………………………………. 11تصویر1-3: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………………………………… 11تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون ………………………………….. 13تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها ……………………………………………………………………………………… 14تصویر 1-8-بیماریزایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ………………………………………………………………………… 16تصویر1-9:عکس قفسه سینه بیماری که به سل مبتلاست توسط اشعه ایکس …………………………………………. 20تصویر 1-10-داروهای مورد استفاده برای درمان بیماری سل ……………………………………………………………. 21تصویر 1-11- دام مبتلا به سل، ضایعه سلی در بافت ریه……………………………………………………………………. 24تصویر 1-12- مسیر انتقال مایکوباکتریوم بویس ………………………………………………………………………………… 29تصویر1-13:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………………………………………. 41تصویر1-14:ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………………………………………. 41تصویر1-15:ژنوم کامل سویه H37Rv مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ……………………………………………………….. 42تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش REA …………………….. 46تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش RFLP …………………… 46تصویر1-18: قطعات IS6110 و لوکوس DR در ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس H37RV ……………………….. 51تصویر1-19 : لوکوس DR و یک توالی فاصله انداز را DVR میگویند ………………………………………………… 51شکل 1-20 : حذف توالی های فاصله انداز، که ممکن است در یک یا چند توالی فاصله انداز باشد …………. 52تصویر2-1: مومیایی یافت شده در کـشور مصر ……………………………………………………………………………………. 57تصویر 3-1: نمونهای از عقدههای لنفاوی …………………………………………………………………………………………. 71تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد کینیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون………………. 75تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد کینیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی …………….. 76تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگآمیزی فلوئوروکروم …………………………………………………………………… 81تصویر 3-5: لولههای تست نیاسین مثبت و منفی ……………………………………………………………………………….. 82تصویر 3-6- نمائی از لولههای کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس ……………………………………………………….. 83تصویر3-7: دستگاه نانودراپ ………………………………………………………………………………………………………….. 88تصویر 3- 8: صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ ……………………………………………………………………….. 88تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر ………………………………………………………………….. 89تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی ………………………. 90تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی ………………….. 92تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینهای ………………………. 97تصویر 3-13: دات بلات PGRS و DR ………………………………………………………………………………………………………………. 102تصویر4-1- لوله های لونشتاین- جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی ……………………………….. 106تصویر4-2- الکتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110 ……………………………………. 107تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه …………………………………………………………………………………… 108شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP …………………………………………………………………………… 109تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II ……………………………………….. 110تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS …………………………………………………. 111تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR ………………………………………………………. 112
چکیده:
بیماری سل گاوی ناشی از مایکوباکتریوم بویس دربسیاری از کشورها ازجمله ایران شیوع دارد برای کنترل وریشه کنی این بیماری، شناسایی منبع عفونت، مسیر انتقال وحیوانات ناقل الزامی است، که این امربا استفاده از تمایز بین سویه های مختلف مایکوباکتریوم بویس، توسط تکنیک های مولکولی ازجمله RFLP صورت می پذیرد. جهت بهینه سازی وتسریع برنامه ریشه کنی دراین تحقیق، تکنیک RFLP توسط آنزیم Pvu II با استفاه از پروب های PGRS و DR از نظر تنوع الگوی ژنومی وشناسایی بهتر سویه ها مورد مقایسه قرارگرفتند.
در مطالعه حاضر طی سالهای 1388 تا 1390 از 65 نمونه ی مشکوک به سل استان خراسان ارسالی به آزمایشگاه رفرانس مایکوباکتریومهای بیماریزای دام موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، پس از کشت، تعداد 12مورد اسمیر مثبت شناسایی گردید که پس از استخراج DNA و ارزیابی آنها تعداد 8 جدایه مناسب RFLP توسط دوتکنیک فوق مورد بررسی قرارگرفتند. جدایه های مورد نظر بر روی محیط کشت لونشتاین جانسون پیرووات دار و گلیسرینه کشت داده شدند. کلیه جدایه ها به روش مولکولی و بیوشیمیایی تعیین هویت گردیدند. از کلنی های مشخص طبق روش ون- سولینگن ، DNA باکتریایی استخراج شد. سپس DNA های مایکوباکتریوم بویس جدایه گاوی توسط آنزیم محدود کننده Pvu II هضم و الگوهای بدست آمده با روش RFLP پس از هیبریداسیون با پروب های PGRS و DR با یکدیگر مقایسه شدند. در هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد.
این تحقیق شواهد محکمی براین است که در گاوهای استان خراسان مایکوباکتریوم وجود دارد و احتمال انتقال به انسان و ایجاد بیماری سل حتمی است. لازم به ذکراست که تحقیق حاضر اولین مطالعه مولکولی برروی مایکوباکتریوم در گاوهای استان خراسان می باشد، لذا تعمیم برنامه های مبتنی برشناسایی مایکوباکتریومها در سایر استانها برای ردیابی عامل سل درگاوها و ارتباط آن با بیماری سل درانسان ضروری است.
کلید واژه: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس- تعیین هویت مولکولی – RFLP PGRSDR,

فصل اول
مقدمه و کلیات
1-مقدمه:
سل یک بیماری واگیردار است. تقریبا یک سوم جمعیت جهان (یعنی 2 میلیارد نفر) به میکروب سل آلوده و در خطر ابتلا به بیماری قرار دارند و هر ساله حدود 9 میلیون نفر به سل فعال مبتلا شده و حدود 5/1 تا 2 میلیون نفر در اثر این بیماری جان می سپارند. شیوع مجدد بیماری در دو دهه اخیر نشان دهنده درگیر بودن تمام کشورها با مایکوباکتریوم‌ها1 بوده است. بیش از 90 درصد موارد بیماری و مرگ ناشی از سل در کشورهای در حال توسعه رخ می دهد. با جهانی شدن بیماری مهلک ایدزومساله حائز اهمیت مقاومت چند داروئی که نتیجه مدیریت ضعیف درمان سل است، سازمان بهداشت جهانی(WHO) درمجمع سال 1991 ضمن اعلام بیماری سل به عنوان یک اورژانس جهانی، کاهش هر چه سریع تر میزان شیوع مرگ و میر و به تبع آن میزان بروز سل را در اهداف کلی خود و کشورها قرار داده و سپس با معرفی راهبرد DOTS زمینه کنترل بیماری را بطور نسبی فراهم آورد. در حال حاضر با توجه به دادههای آماری سل یکی از بزرگترین علت مرگ ناشی از بیماریهای عفونی تک عاملی بوده(حتی بیش از ایدز، مالاریا و سرخک) و دارای مرتبه دهم در بار جهانی بیماری هاست و پیش بینی می شود تا سال 2020 همچنان جایگاه کنونی را حفظ کند و یا تا مرتبه هفتم بالا رود. (هاین و کریمر2، 2012).
باسیل این بیماری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یا باسیل کخ نام دارد زیرا که در سال ???? (میلادی) پرفسور رابرت کخ دانشمند آلمانی آن را کشف کرد. بیماری سل گاوی یکی از قدیمی ترین بیماریهای عفونی مشترک بین انسان و دام است که قدمت آنرا به اندازه حیات بشریت می‌دانند و از گذشته‌های دور مورد شناسایی قرار گرفته است. (سینگ و ورما3، 2004).
سل گاوی که عامل آن مایکوباکتریوم بویس میباشد، یکی از اعضای گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس است. این بیماری یکی از مهمترین بیماریهای عفونی خانواده بویده به ویژه گاوها و خانواده کاپرینه به ویژه بزها در سراسر دنیا از جمله ایران میباشد و سالیانه رقم قابل توجهی را برای پیگیری و ادامه برنامه ریشه‌کنی به خود اختصاص میدهد. در ایران علیرغم به کارگیری برنامه ریشه کنی سل گاوی با این که شیوع این بیماری در گاوداریهای صنعتی بشدت کاهش پیدا کرده است ولی هنوز سل گاوی در دامداری های کشور دیده می‌شود به همین منظور برای کنترل بیماری سل گاوی برنامه های ریشه کنی و کنترل از سال 1334 مورد اجرا درآمده و نتایج نشان میدهد که از17 % به 14/0% کاهش یافته است. علوی (1388) برنامه های تست و کشتار دام های آلوده، ‌مسیر نقل و انتقال دام ها و شناسایی منبع عفونت و تکنیک های مولکولی و بیوشیمیایی توانسته اند با شناسایی سویه های مایکوباکتریومها از پیشرفت و شیوع ْآن جلوگیری نمایند. داوید و همکاران4 (1987) شناسایی سریع عفونت در گله های گاوهای کشور برای جلوگیری از انتقال یک امر ضروری میباشد زیرا مایکوباکتری های پاتوژن دارای دوره انکوباسیون طولانی مدت بوده و این امر تشخیص آزمایشگاهی آن را با مشکل مواجه می‌سازد. امروزه از مطالعات اپیدمیولوژی سل در ارزیابی برنامه های کنترل بیماری، تعیین بروز و میزان شیوع و از ژنوتایپینگ ایزوله ها و مولکولار اپیدمیولوژی در قرابت و طبقه بندی سویه ها، ارتباط بین سل حیوانات مختلف و سایر فاکتور های دخیل در آن و همچنین ردیابی منشاء عفونت استفاده های شایانی می‌نمایند. لذا بکارگیری روش های نوین جهت تشخیص این بیماری بسیار ضروری میباشد. امروزه تکنیک های مولکولی مانند انگشت نگاری ژنومی به روش 5RFLP، برای شناسایی دقیق و متمایز نمودن ایزوله های مایکوباکتریوم میباشد. داوید و همکاران(1987) پروب ها قطعه ای از ملکول های تک رشته ای RNAیا DNA هستند که به روشهای مختلف نشان دار یا لیبل میشوند. این پروب ها با توالی نوکلئوتیدی مکمل خود با DNAی هدف، در شرایط ویژه آزمایشگاهی هیبرید می‌شوند. سپس نواحی هیبرید شده به طرق مختلف ردیابی شده تا تفاوت سویه ها به لحاظ جایگزینی پروب در نواحی خاص کروموزم نمایان گردند. پریراز و همکاران6(2012) در این مطالعه سعی شده است جدایه‌های بدست آمده باتکنیک RFLP با آنزیم PvuIIو استفاده از پروب‌های PGRS 7 و DR8 از نظر تنوع الگوی ژنومی مورد مقایسه قرار گیرند.
اهدف تحقیق:
از آنجائیکه در بحث کنترل منطقه ای سل و ردیابی منشاء عفونت این بیماری، به قدرت تفکیک گونه ها و سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکسنیاز میباشد، تحقیقات اپیدمیولوژی مولکولی شکل جدیدی را به خودگرفته است. در همین راستا و در امر کنترل و ریشه کنی بیماری سل گاوی شناسایی منابع عفونت، مسیرهای انتقال و پیدا نمودن مخازن از چالش های اصلی است و تمایز سویه های مختلف مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس در تمامی استان‌های کشور الزامی به نظر میرسد.تکنیک‌های جدید مولکولی، برای متمایز نمودن سویههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از منابع مختلف و جهت بررسی‌های اپیدمیولوژی ابزارهائی کارا به شمار می آیند(می هی و همکاران9، 2011).
با وجود انجام مطالعات متعدد در مناطق مختلف ایران در ارتباط با مولکولار اپیدمیولوژی این بیماری اطلاعات چندانی در این زمینه در استان خراسان در اختیار نبوده و بررسی شیوع مجدد بیماری سل و ارزیابی ریشه های انتقال در این استان از اهمیت ویژه ای برخوردار است. به همین منظور در این تحقیق سعی بر این است که با استفاده از تکنیک‌های تایپینگ مولکولی(انگشت نگاری ژنومی مایکوباکتریوم ها) مانند RFLP(پلی مورفیسم قطعات به وسیله آنزیم های محدودکننده) و با بهره گیری از متمایز کننده ترین روش های توصیه شده در تحقیقات گذشته، تمایز بین سویه های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده از گاوهایتوبرکولین مثبت استان خراسان صورت پذیرد تابتوان از یافته‌های تحقیق در اهداف فوق بهره جست.
در مطالعه حاضر دو هدف دنبال میگردد:
1- استفاده از تکنیک های براساس PCR همچون IS6110 در جهت تعیین هویت جدایه های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
2- استفاده از تکنیک DR-PGRS – RFLP در جهت بررسی ژنتیک جمعیتی جدایه های مورد مطالعه و تعیین ژنوتیپ های موجود در استان خراسان
1-1-بیماری سل:
مرض سل یا توبرکلوز (TB) یکی از بیماریهای مهلک در جهان است که عامل آن مایکوباکتریوم‌ها یا به طور دقیقتر مایکوباکتریومهای سلی است. در بیماری سل معمولا ششها مورد حمله قرار می‌گیرد، این نوع سل را تی بی ریوی نیز گویند ولی از سایر اعضای درگیر در سل می‌توان سیستم عصبی مرکزی، غدد لنفاوی و گردش خون، دستگاه تناسلی وادراری، دستگاه گوارش و معده، استخوان‌ها و مفاصل و پوست رانام برد. سایر مایکوباکتریومها مانند بووی، افریکنم، میکرتی و کانتی نیز باعث بیماری می‌شوند ولی نادر هستند. از انواع نشانه‌های سل می‌توان به سرفه مزمن همراه با خلط سینه اغشته به خون، تب، تعریق شبانگاهی و کاهش وزن اشاره کرد. سل را می‌توان با رادیوگرافی قفسه سینه، تست پوست و خون و بررسی میکروسکوبی وکشت میکروبی خلط و مایعات بدن درازمایشگاه تشخیص داد. درمان سل مشکل است وبه دوره‌های طولانی و استفاده از انتی بیوتیک‌های متفاوت نیاز دارد همچنین باید رفتار وتماس افراد کنترل شود. گونه های مقاوم به آنتی بیوتیک مایکوباکتریوم در سالهای اخیر درمان سل را با مشکل روبه رو کرده است.
تصویر1-1 : شیوع بیماری سل در سال 2010در هر 100000نفر. قهوه ای بیشتر از 300، بنفش=299-100، خردلی=99-50 ،نارنجی=49-25،زرد 24-1 و خاکستری صفر
پیشگیری از الوده شدن به سل وکنترل تماسهای افراد وهمچنین واکسیناسیون توسط واکسن ب ث ژ بهترین شیوه مبارزه با سل است. باکتری‌های سل می‌توانند توسط عطسه وسرفه ویا تف کردن افراد آلوده به سل در محیط پخش شوند. در حال حاضر حدود یک سوم جمعیت جهان به باکتری‌های سل نوع ضعیف آلوده‌اند وسرعت آلوده شدن افراد درحال حاضر یک نفر در هر ثانیه‌است هرچند بسیاری از این عفونت‌ها به صورت نهانی هستند. حدود یک دهم این عفونت‌ها نهایتا به سل آشکار تبدیل می‌شوند واگر بدون معالجه رها شوند بیش از نیمی از آنها به مرگ منجر می‌شود. عزیزی، فریدون (1379) در سال ???? حدود 14.6 ملیون نفردر جهان از بیماری نوع شدید سل رنج می‌برند وحدود 8.9 ملیون نفردر جهان مستعد نوع شدید سل هستند وحدود1.6 ملیون نفر نیز بر اثر سل مردند. بیشتر این آمار مربوط به کشورهای جهان سوم است اما این آمار حتی در کشورهای پیشرفته نیز رشد داشته دلیل این امر می‌تواند کم کاری در زمینه واکسیناسیون و یا گسترش بیماری ایدز ‌باشد. حدود ??? افراد سلی در آسیا و آفریقا هستند ودرآمریکا حدود ? تا ?? درصد به آزمایش سل جواب مثبت داده‌اند. در آمریکا????? نفر مستعد سل وجود دارد وحدود ??? سل در آمریکا به دلیل مهاجرت افراد آسیایی و آفریقایی رخ می‌دهد.
با شروع عملیات ریشه کنی سل گاوی در ایران از سال 1337 به تدریج موارد سل گاوی کاهش یافته به طوریکه با استفاده از تست توبرکولین و کشتار گاوهای آلوده، آلودگی سل گاوی در کشور ازحدود 5% در سال1351 به 12/0 در صد در سال 1383 رسید. بدین ترتیب با کنترل بهداشتی دامداری‌ها و کشتارگاه‌ها موارد سل گاوی کاهش یافت و با پاستوریزاسیون و جوشاندن شیر، بیماری ناشی از سل گاوی در انسان به تدریج رو به نقصان گذاشت.

1-2-مایکوباکتریوم ها:
مایکوباکتریومها، ارگانیسم های میله ای شکل، نازک وبدون تحرک متعلق به خانواده مایکوباکتریاسهورده اکتینومیستالها وکلاس اکتینومیسه میباشند. موًید و همکاران10 (2012) نام مایکوباکتریوم به معنی باکتری قارچی است که به خصوصیت قارچ مانند باسیل سل اشاره دارد. لمیشنکو و همکاران11(2008) در حال حاضر تا ژانویه سال 2010 تعداد 158 گونه مختلف در جنس مایکوباکتریوم شناسایی شده است. آسیمو و مد12(2008) این گونه ها طیف وسیعی ازعفونتهای موضعی تا بیماریهای منتشر را در انسان و حیوانات ایجاد میکنند. اگرچه بعضی از گونه ها فقط درانسان عفونت ایجاد می کنند ولی سایرگونه ها ازحیوانات گوناگونی جدا شده است. همچنین گونه های زیادی درآب وخاک یافت میشوند. از بسیاری جهات، مایکوباکتریومها را براساس تفاوتهای بنیادی دراپیدمیولوژی وبیماری، به دوگروه اصلی زیرتقسیم می شوند.:
1-کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شامل (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم آفریکانوم، مایکوباکتریوم بویس BCG، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم پینیپدی، مایکوباکتریوم کاپره، مایکوباکتریوم میکروتی، مایکوباکتریوم کانتی) که کند رشد وکلنی آنها فاقد پیگمان می باشند.
2- مایکوباکتریومهای غیرتوبرکلوزیس(NTM)
1-2-1-نامگذاری
جنس مایکوباکتریوم یکی ازقدیمیترین جنسهایی است که مورد تعریف قرارگرفته است. نام ژنریک مایکوباکتریوم برای اولین بار به گروهی از ارگانیسم ها که برروی محیط های مایع به صورت لایه ای نازک شبیه کپک میروئیدند، اطلاق میگردید. لمیشنکو و همکاران (2008) درشروع قرن اخیرخصوصیاتی را که برای مایکوباکتریهاتعریف میکردند شامل نداشتن حرکت، مورفولوژی باسیلی شکل کمی خمیده ومیله ای شکل وخصوصیت مقاومت به اسید و الکل متعاقب رنگ آمیزی با فوشین فنی که (رنگ آمیزی ذیل نلسون) بود. راستوجی و همکاران13 (2001) در راسته اکتینومایستالز، مایکوباکتریوم متعلق به جنس مایکوباکتریوم بوده که تنها جنس خانواده مایکوباکتریاسه میباشد. مایکوباکتریاها، به عنوان اکتینومیستهای هوازی، مقاوم دربرابراسید والکل، میله ای شکل وگاهاً با توانائی ایجاد شاخه بدون ایجاد هیفه هوائی، تعریف میشوند. این باکتریها غیرمتحرک وبدون هاگ بوده و دردیواره سلولی دارای آرابینوز، گالاکتوز و مزودی آمینو پیمیلیک می باشند و نسبت درصد بازهای گوانین و سیتوزین، دراسید هسته ای شان(DNA) درحدود 62 تا 70 مول درصد می باشد(بجزمایکوباکتریوم لپره که درصد بازهای GC آن 58 %است). مایکولیک اسیدشان دارای وزن مولکولی بالا(60تا90کربن) بدون ترکیبات با بیش از دو پیوند دوگانه غیراشباع می باشد(گوترزو همکاران14، 1995).
از قدیم این ارگانیسم ها را فاقد کپسول قلمداد میکردند لیکن درحال حاضر مایکوباکتریها را همراه با ساختمان کپسولی شکلی می شناسند(96). این ارگانیسم ها را به طور اولیه به عنوان هوازی های اجباری قلمداد مینمودند، ولی برخی از گونه ها وسویه ها، میکروائروفیلیک بوده و به صورت نوارباریکی در زیر سطح محیط های نیمه جامد رشد می نمایند. اکتینومیست ها از نقطه نظر خصوصیات اکولوژیکی ومورفولوژیکی شامل میکروارگانیسم های متفاوتی می باشند. دور و همکاران15 (2000) تمامی مایکوباکتریها و میکروارگانیسم های وابسته مثل اعضای (کورینه باکتریوم، مایکوباکتریوم ونوکاردیا و گروهی که شامل جنس های رودوکوکوس، گوردونه و تسوکامورلا می باشد) براساس توانائی تولید مایکولیک اسید دارای وزن مولکولی بالای اسید چرب? هیدروکسی با زنجیره بلند جانبی? متمایز می شوند. دور و همکاران (2000) اعضای گروه کورینه باکتریوم، مایکوباکتریوم و نوکاردیا[CMN] تنها میکرارگانیسم هایی هستند که قادر به سنتز مایکولیک اسیدمی باشند. دور و همکاران (2000)
جدول1-1نامگذاری مایکوباکتریوم ها

1-2-2-طبقه بندی مایکوباکتریوم ها:
در گذشته نامگذاری عفونتهای مایکوباکتریایی، بدون در نظر گرفتن نوع ارگانیسم به مایکوباکتریهای سلی و مایکوباکتریهای غیرسلی(همچنین عبارت مایکوباکتری های آتیپیک یا مایکوباکتری های مجزا از گروه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس) محدود می‌شد. اولین تقسیم‌بندی شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل سل انسانی، مایکوباکتریوم بویس مسئول سل گاوی، مایکوباکتریوم آفریکانوم16 مسبب سل انسان و اساسا محدود به آفریقا، مایکوباکتریوم میکروتی17 پاتوژن جوندگان کوچک و سویه واکسینال مایکوباکتریوم ب.ث.ژ. بود. با ظهور تکنولوژی تعیین توالی اسیدهای نوکلئیک و ژنوتایپینگ این امکان به وجود آمده است که ارتباط بهتری در توصیف مجدد ژنوتایپینگ وفنوتایپینگ موجود، فراهم شود. این موضوع در تشخیص گونه های جدید هم موثر بوده است. نامگذاری باکتریها به وسیله کد بین المللی صورت گرفته ونام صحیح مربوط به طبقه باکتری بر اساس درج باکتری در منابع معتبر علمی که دارای نشر طولانی و اعتبار قانونی در مجامع علمی هستند صورت میگیرد. از اوایل ژانویه1980 نام باکتری های قبلی بر اساس لیست تائید شده نامگذاری باکتری انجام گرفت وهر باکتری که نام آن در لیست موجود نبود در نامگذاری قرار نمی گرفت. براساس علائم کلینیکی مهم، مایکوباکتریوم ها به3 گروه اصلی طبقه بندی میشوند:
1- شدیداً پاتوژن، ازجمله پاتوژنهای انسانی شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم لپره و پاتوژنهای حیوانی شامل مایکوباکتریوم بویس، که قادرند به بافت های طبیعی حمله و بیماری فعال و پیشرونده ایجاد کنند.
2- پاتوژنهای فرصت طلب یا) پاتوژنهای بالقوه ( شامل مایکوباکتریوم سیمیه18،مایکوباکتریوم آویوم19 ومایکوباکتریوم گزنوپی که به طور طبیعی و آزادانه در محیط زندگی می کنند و بصورت فرصت طلب باعث بیماری در انسان و حیوانات می شوند.
3- ندرتاً پاتوژن شامل ساپروفیت هایی مانند مایکوباکتریوم فله ای20و مایکوباکتریوم اسم گماتیس21در میان مایکوباکتریوم ها عبارت22 (MAIS)قبلا به گروهی از مایکوباکتریوم های کند رشد که شامل کمپلکس مایکوباکتریوم آویوم، مایکوباکتریوم اینتراسلولار23، مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوم24می باشد، اطلاق می شد که از نظر خصوصیات ظاهری به هم شبیه و در برخی مواقع تفریق آنها از یکدیگر مشکل بود. راستوجی (1992) امروزه واژه MAIS کاربرد چندانی ندارد به طوری که با استفاده از تکنیک هائی مانند هیبریدیزاسیون اسید هسته ای25، آنالیز آنتی ژنی وتوانایی ارگانیسم در هیدرولیز اوره، مایکوباکتریوم اسکوروفولاسئوم به راحتی از مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم اینتراسلولار قابل تفکیک است. واژه دیگری که بسیار کاربرد دارد، کمپلکس مایکوباکتریوم آویوم(MAC) است که در برگیرنده دوگونه مایکوباکتریوم آویوم و مایکوباکتریوم اینتراسلولار می باشد که قبلا از سه تحت گونه مجزا به نامهای مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه آویوم، مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس و مایکوباکتریوم آویوم تحت گونه سیلواتیکم تشکیل می شد( آرونی تانگ وان و همکاران26، 2010).
در بین گروه مایکوباکتریوم آویوم، مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس به جهت نیاز به مایکوباکتین در محیط کشت از بقیه به راحتی قابل تفریق است (میانگین تقسیم آن 48ساعت و مدت زمان رشد حدود 16هفته). همچنین گاهی اوقات مایکوباکتریوم ها را به دو گروه می شناسند، یک گروه به نام کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم آفریکانوم، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم بویس BCG، مایکوباکتریوم میکروتی وگونه های که جدیداً شرح داده شده بنام مایکوباکتریوم کانتی، مایکوباکتریوم پینیپدی)می باشد وگروه دیگر مایکوباکتریهای غیراز کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (MOTT)27بوده و عبارت مایکوباکتریهای “غیرسلی” یا “آتیپیک” مترادف با MOTTاست (ام سی لرنون و همکاران، 2010).
معمولا ًونه الزاماً مایکوباکتریوم های فرصت طلب، پاتوژنهائی کند رشد با میانگین تقسیم12-24ساعت بوده ومیانگین لازم برای رشد آنها در محیط کشت اختصاصی حدود 15تا28 روزاست. البته این در مورد مایکوباکتریوم لپره28استثنا میباشد زیرا این باکتری توانائی رشد بر روی محیط مصنوعی را نداشته و تکثیر آن درحیوانات آزمایشگاهی بین 7 تا 14روزبطول می انجامد. سازمان بهداشت حیوانات29 (2009) درمقابل بسیاری ازپاتوژن های نادر یا گونه های دیگر مایکوباکتریوم های ساپروفیت هم وجود دارند که دارای رشد سریعی بوده و متوسط تقسیم آنها بین 2 تا 6 ساعت متغیراست و زمان لازم برای رشد روی محیط کشت، درمورد باکتری های اخیر 1تا 7 روزاست. (سازمان بهداشت حیوانات 2009)
1_2_3_مورفولوژی و خصوصیات میکروسکوپی:
تصویر1-2-مایکوباکتریوم ها و دیواره سلولی آنها
مایکوباکتریوم ها ارگانیسم های میله ای شکل باریک، کمی خمیده یا مستقیم به طول 10-2 میکرون و عرض 4/0_2/0 میکرون هستند که با ظاهری دانه دانه به رنگ قرمز درخشان در زمینه آبی دیده می شوند. مطالعه با میکروسکوپ الکترونی نشان می دهد که مایکوباکتریوم ها پروکاریوت هستند و مواد هسته، از جمله DNA، به وسیله غشا از سیتوپلاسم جدا نیستند. شکل آنها به وسیله یک دیواره ضخیم و محکم شامل دو لایه حاجب – الکترون که به وسیله لایه کم تراکم دیگری از یکدیگر جدا شده اند حفظ می شود و حذف دیواره سلولی به کمک مواد شیمیایی، شکل میله ای آنها را به صورت ساختمان کروی یا اسفروپلاست تغییر می دهد (علوی، 1388).

تصویر1-3: عکسبرداری توسط میکروسکوپ الکترونی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
ضخامت دیواره سلولی حدود 100 تا 200 آنگستروم است. زیر دیواره سلولی، غشای سیتوپلاسمی وجود دارد که شامل دو لایه به قطر 30 آنگستروم است و یک لایه کم تراکم به قطر 3 آنگستروم و در وسط آنها قرار دارد. در سلول در حال تقسیم این دیواره سیتوپلاسمی به طرف داخل پیشرفت می کند تا تقسیم سلولی کامل شود. مطالعات مختلف در مراحل متفاوت رشد مایکوباکتریوم ها ، وجود ذرات کوچکی به اندازه تقریبی 120×80 آنگستروم را در سیتوپلاسم نشان می دهد که ریبوزوم نامیده می شوند و تعداد آنها از ابتدای مرحله لگاریتمی رشد تا مراحل آخر لگاریتمی افزایش می یابد. این ذرات با رشته هایی به قطر حدود 7 آنگستروم به یکدیگر متصل می شوند و پلی ریبوزوم را تشکیل می دهند.
هسته مایکوباکتریوم ها شامل رشته هایی است که احتمالا یک مولکول DNA مارپیچی درازبه طول 30 آنگستروم می باشد. به نظر میرسد که مایکوباکتری ها، ارگانیسم های یک هسته ای هستند. بررسی های بیوشیمایی نشان می دهد که DNA مایکوباکتریوم ها یک مولکول دو رشته ای حاوی مقادیر زیاد گوانین و سیتوزین است و وزن مولکولی آن در حدود 109× 6/4-5/2 دالتون بر آورد شده است (پالومین، 2007; سزاوار30، 2008).
1-2-4-خصوصیات رشد مایکوباکتریها
برخلاف سایر باکتریهای بیماریزا که بیهوازی یا هوازی اختیاری هستند، باسیل سل هوازی اجباری است و میتواند در محیطهای کشت مصنوعی ساده حاوی گلیسرین به عنوان منبع کربن و املاح آمونیوم به عنوان منبع ازت رشد کند. آسپاراژین یا مخلوطی از اسیدهای آمینه معمولا به محیط کشت افزوده میگردند تا شروع رشد را تسهیل و سرعت آنرا بهبود بخشند. اگرچه مایکوباکتریوم ها به اثر مهارکننده مواد چربی در محیط کشت خیلی حساسند ولی مقادیر اندک اسیدهای چرب با زنجیر طویل موجب تحریک آنها میشوند.pH مناسب رشد مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حدود6 تا 8 وpH متوسط آن5/6-6است. اختصاصات رشد برحسب سویه باسیل، محیط رشد و غیره متفاوت است. رشد باسیل سل در محیط های کشت جامد، مثل محیط تخم مرغ، انبوه وفراوان است و پرگنه ها برجسته، زبر با ظاهری گل کلمی یا مخروطی نامنظم، خشک وشکننده می باشد (تصویر1-4). سرعت رشد باسیل سل چه در محیط کشت و چه دربدن حیوانات کند است ولی بعضی از مایکوباکتریوم های ساپروفیت رشد سریعتری دارند وبه طور کلی سرعت رشد مایکوباکتریومها خیلی آهسته تراز سایرباکتریها است(کول31، 2002).
تصویر1-4: کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس روی محیط لونشتاین جانسون
1-2-4-فاکتورهای ویرولانس:
دیواره سلولی مایکو باکتریومها از نظر ساختمان شیمیائی ترکیبی از پپتیدو گلیکان، آرابینو گالاکتان و اسید مایکـولیک و همــچنین لیپیدهائی همــانند مایکوزیدهـا، Cord Factor و سـولفالیپیدها بوده که این اجـــزاء دیـــواره سلولــی در پاتوژنز باسیلهای سلــی نقــش دارند. ( با اینکه پاتوژنیسیته مایـکوباکتریوم توبرکولوزیس بوجــود فاکتورهــای گوناگون لیپیدی وابسته است اما تا به امروز مکانیسمی که تــوسط آن باسیلهـای سلی از فعالیت لیتیک فاگو سیتوز فرار می کنند، شناخته نشده است . ) پپتیدو گلیکان که اسکلت دیواره سلولــی را شکل می دهــد شامــل اسیدN گلیسرول مورامیک وN استیل گلوکز آمین ( اتصال یافته بوسیله اسیدهای آمینه ) میباشد. این ساختمــان شبکه مانند ( پپتیدوگلیکان ) بوسیله آنزیم لیززوزیم شکافته شده و در بیشتر ترشحــات میزبان حضـــور پیدا میکند و در نهایت دی پپتیـــد مورامیل ( M D P ) تولید شده، که فعالیت ایمونولوژیک قوی دارد . میزان جزء لیپیدی مایکو باکتریاها بالا است و احتمالاً در حدت و ایجاد واکنــش ایمونولوژیک در برابر آلودگی نقشی مستقیم بعهــده دارند. راستوجی(1992) البته بعلت پیچیــدگی هــای این لیپیــدها هنــوز مفهومــی درست از نقش و ساختمــان آنها بدست نیامده است. خاصیت هیدروفوبیسیتی( آبگریزی ) لیپیدهای موجود در دیواره سلولی ممکـن است نقشی مهم را در مقاومت دهیدراتاسیون و بقاء ارگانیسم در شرایط نامســاعد ایفاء نماید. لیپیدهای مایکوباکتریال شامل اسیدهای مایکولیک، گلیکولیپیدها و واریته های دیگر میباشد. اسیدهای مایکولیک از اسیدهــای چرب منشـعب شده و در مایکــو باکتریوم، نوکاردیا و کورینه باکتریوم یافت میشوند. اما وجــود اختلافــات عمده ای که در الگـــوهای این لیپیدها وجود دارد امکان ایجاد یک سیستم تشخیصی( بیشتر برای مایکو باکتریها ) را بر اساس آنالیز لیپیدها بوسیله تکنیک کروماتوگرافی لایه نازک فراهم آورده است.
تصویر1-5- دیواره سلولی مایکوباکتریوم ها
گلیکو لیپیدهای مایکوباکتریومها خصوصاً سولفالیپیدها احتمالاً با حدت باکتری ارتباط داشته اما این ارتباط، رابطه ای ساده نیست. ممکن است سولفالیپید ها مانع از تشـکیل لیزوزوم فاگوزوم شده و یا از لیز باکتــــری در فاگوسیتها ممانعت کننــد. راستوجی(1992) سولفــالیپیدی بنامCord Factor و? دی مایکول ترهالوز از مایکو باکتریوم بوویس و مایکو باکتریوم توبرکولوزیس حدت دار جدا شده و اعتقاد بر این است که بطور عمــده بعنوان فاکـتور حدت بوده زیرا بروشنی دارای خــواص توکسـیک می باشد اما عاملـی مهم در ایجاد بیماری نمی باشد. از سایر لیپیدها میتوان موم D هتروژنوس را نام برد که در مایکو باکتریوم توبرکولوزیس شامل پپتیدو گلیکــان بوده اما در مایکو باکتریوم بوویس پپتیدو گلیکان کمتری داشته و بیشتر محتوی لیپو پلی ساکارید است. فعــالیت قوی موم D مربوط به حضـــور دی پپتید مورامیل بوده و توانائی ایجاد گرانولوماس را نیز دارد.
1-2-6-آنتی ژنهای مایکو باکتریوم ها :


پاسخ دهید